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ELISA實驗中的FAQ（二）
1、整體OD值過高，標(biāo)準(zhǔn)品OD值過飽和
遇到這樣的情況，首先檢測標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋情況，確保標(biāo)準(zhǔn)品濃度的正確稀釋。在標(biāo)準(zhǔn)品確保無誤后，若孔板顯色明顯，可參考以下原因及解決方法：
?顯色時間過長或孵育溫度錯誤
解決方法：根據(jù)試劑說明書提供的孵育溫度，適當(dāng)縮短Avidin-HRP或顯色底物的孵育時間。
?洗滌次數(shù)不夠
解決方法：嚴(yán)格按照說明書的洗滌次數(shù)進行
?試劑配制不正確（如檢測抗體、酶等稀釋度是否正確）
解決辦法：嚴(yán)格按照試劑說明書進行試劑的配制
?混用其他試劑盒試劑
解決方法：使用本試劑盒內(nèi)配套試劑，不同品牌及不同批次間的試劑之間可能存在不匹配現(xiàn)象
?使用污染的去離子水或者buffer稀釋試劑盒中的試劑
解決方法：使用新鮮的無污染的去離子水或者buffer稀釋試劑
2、標(biāo)準(zhǔn)品OD值正常但樣本OD值過高
?樣本濃度過高
解決方法：稀釋樣本，進行預(yù)實驗確定樣本稀釋倍數(shù)
3、試驗結(jié)果空白背景高
?洗板不干凈
解決方法：充分洗滌，徹底拍干；洗板要防止交叉污染；濃縮洗液準(zhǔn)確配制；槍尖盡可能一次性使用；加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染；濃縮洗滌液如有結(jié)晶則應(yīng)讓結(jié)晶于室溫全部溶解后再量取稀釋
?顯色液變質(zhì)或者試劑過期
解決方法：檢查試劑盒有效期，如果發(fā)現(xiàn)顯色液顏色變化或試劑過期，請勿使用
?試劑稀釋有誤，如加酶的濃度過高
解決方法：嚴(yán)格按說明書所示稀釋倍數(shù)配制
?蒸餾水受酶等污染
解決方法：使用新鮮蒸餾水
?試劑混用
解決方法：不同批號試劑勿混用
?培養(yǎng)箱溫度超過37℃或反應(yīng)時間過長
解決方法：校正培養(yǎng)箱溫育溫度或顯色反應(yīng)時間適當(dāng)縮短
?檢測試劑加多
解決方法：確保試劑正確稀釋或降低檢測試劑的使用濃度
?添加終止液后等候太長時間才進行讀板
解決方法：添加終止液后10分鐘內(nèi)進行讀板
?抗體出現(xiàn)非特異性結(jié)合
解決方法：使用合適的封閉緩沖液，比如BSA或5-10%的正常血清。如果使用直接偶聯(lián)的檢測抗體， 則封閉緩沖液種類與一抗相同；如果使用偶聯(lián)二抗，則種類與二抗相同。確保孔已經(jīng)過預(yù)處理以防止非特異性附著。
?高抗體濃度
解決方法：嘗試不同的稀釋度以優(yōu)化結(jié)果
?底物孵育在燈光下進行
解決方法：底物孵育應(yīng)在黑暗中進行或遵循說明書操作
?添加底物后會在孔中形成沉淀
解決方法：增大樣品的稀釋倍數(shù)或降低底物濃度
?酶標(biāo)板不干凈
解決方法：清洗酶標(biāo)板底部
4、實驗結(jié)果白板
試驗結(jié)果白板，而且陽性對照孔不顯色，常見原因如下：
?漏加或者誤加試劑
解決方法：檢查試驗記錄和剩余試劑。每次加液前均應(yīng)核對標(biāo)簽
?試劑過期
解決方法：使用有效期內(nèi)的產(chǎn)品
?洗板液配制中出現(xiàn)問題，如量筒不干凈含HRP酶抑制物（疊氮鈉等）
解決方法：使用干凈的器皿，正確配制試劑
?溫育的時間或溫度不夠
解決方法：校正溫育箱溫度和調(diào)整合適的孵育時間
?標(biāo)準(zhǔn)品失活或者丟失
解決方法：標(biāo)準(zhǔn)品正確保存、溶解和混勻
?抗體失活或者丟失
解決方法：更換抗體或者提高抗體濃度
?酶失活或者丟失
解決方法：把工作濃度的酶再稀釋20－100倍，取5uL加入50ul的顯色底物，終止后顯色是否能達到1.0左右，此為酶的粗略估計。更換酶或者提高酶的濃度
?顯色底物失活
解決辦法：加少量的工作濃度的酶，TMB是否很快顯色檢查，若不顯色，則更換顯色底物
5、標(biāo)準(zhǔn)品/樣本復(fù)孔差異大
實驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定的重復(fù)性差，這是典型的由測定操作引起的問題，常見原因如下：
?加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致
解決方法：
①校正移液器，槍尖要配套，確保移液準(zhǔn)確。
②重復(fù)某一樣品時，加樣時間盡可能與第一次接近；
③重復(fù)測定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；
④樣品稀釋前應(yīng)充分混勻；
⑤樣本應(yīng)保持新鮮無異常。
?加樣過快，孔間發(fā)生污染
解決方法：重復(fù)測定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；加樣不要過快
?加錯樣本
解決方法：檢查記錄和試劑，是否加錯樣本
?加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區(qū)
解決方法：加樣槍頭不要貼壁
?不同批號試劑盒中組分混用
解決方法：不同批號試劑盒中組分不可混用
?溫育時間、洗板、顯色時間不一致
解決方法：檢查時間是否一致
?孔內(nèi)污染雜物
解決方法：離心樣品，排除雜物
?試劑/樣品沒有混勻
解決方法：充分混勻樣品和試劑
?洗滌不符合要求，低于3次或者洗板不徹底
解決方法：嚴(yán)格按照說明書規(guī)定進行洗板操作
?血清標(biāo)本未完全凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細胞，易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)等
解決方法：待血清標(biāo)本完全凝固后分離樣本做試驗
?孔中有氣泡
解決方法：確保讀取酶標(biāo)板前不存在氣泡
?邊緣效應(yīng)
解決方法：確保酶標(biāo)板和所有試劑都處于室溫
6、標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度差
?標(biāo)準(zhǔn)溶液配制不當(dāng)
解決方法： 確認是否正確進行稀釋
?標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)融不當(dāng)
解決方法：打開前，短暫離心標(biāo)準(zhǔn)品；檢查復(fù)融后是否有未溶解物質(zhì)
?標(biāo)準(zhǔn)品已降解
解決方法：按說明書推薦方式處理并保存標(biāo)準(zhǔn)品
?曲線與標(biāo)度不合適
解決方法：嘗試使用不同標(biāo)度繪制曲線，例如對數(shù)-對數(shù)、5-參數(shù)邏輯曲線擬合。
-線性圖：一個坐標(biāo)軸表示抗原的濃度，另一個表示讀數(shù)。R2值在此通常用于確定擬合，數(shù)值大于0.99表示擬合非常好。然而，線性圖往往會壓縮曲線下端上的數(shù)據(jù)點，導(dǎo)致計算結(jié)果不準(zhǔn)。
-半對數(shù)圖：幫助抵消線性圖引起的下端壓縮。半對數(shù)圖使用濃度的對數(shù)與讀數(shù)的關(guān)系。這種方法通常會得到數(shù)據(jù)點分布更均勻的S形曲線。
-對數(shù)/對數(shù)圖：為低到中濃度范圍提供良好的線性。但范圍的高點則容易失去線性。
-4或5參數(shù)邏輯（4PL或5PL）曲線：方法更復(fù)雜，考慮了其他參數(shù)比如說高值和低值，因此需要更為復(fù)雜的計算。4PL假設(shè)拐點周圍對稱，而5PL考慮了不對此的情況，通常更適合免疫分析。
如果您的軟件允許，則4PL和5PL將適用于大部分ELISA校正標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果您的軟件不允許，則可選擇是試用半對數(shù)或?qū)?shù)/對數(shù)圖。
?移液出錯
解決方法：使用校準(zhǔn)好的移液器和正確的移液方法。
?標(biāo)準(zhǔn)品溶解方式不正確
解決方法：嚴(yán)格按照標(biāo)簽上說明的方法進行溶解，有些用試劑盒中buffer進行溶解，有些用蒸餾水或者去離子進行溶解等，以說明書為準(zhǔn)
?稀釋方式不正確
解決方法：推薦在PP材質(zhì)的EP管中用Dilution buffer稀釋后加樣
?標(biāo)準(zhǔn)品被污染
解決方法：標(biāo)準(zhǔn)品溶解后不宜放置時間過長，在標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過程中請勿共用槍頭，標(biāo)識要清晰
?出現(xiàn)特異孔
解決方法：剔除特異孔后進行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合
?孵育時未加蓋導(dǎo)致溶液揮發(fā)污染
解決方法：加封口膜或者加蓋進行孵育
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