為了實現ELISPOT的標準化，顯色最好在恒溫箱內進行，溫度控制在25°C±5°C，顯色25分鐘為宜。另外，在37°C顯色也是不錯的一個方法，但要注意相應的縮短顯色時間到12-18分鐘，并且顯色中勤檢查。為了提高ELISPOT檢測結果的可重復性，增加實驗的可信度，必須建立一套標準化的實驗操作規范。標準化的實驗操作規范不僅僅是一些實驗操作，更是一個系統工程，需要提升到實驗室管理與制度架構上來建設。這包括實驗室制度的建立，實驗人員的培訓，實驗程序的建立和標準化，實驗設備、試劑、耗材的選擇與標準化等等。單就實驗流程而言，標準化規范從實驗樣品的采集階段就開始了，一直延續到整個實驗的結束，即數據分析處理的完成。參見圖1。

如右圖所示，影響到ELISPOT斑點頻率的因素很多，我們來逐一分析。

細胞類型
通常我們用來做ELISPOT檢測的細胞有血液來源的PBMC和脾臟來源的淋巴細胞。也有的實驗者需要用到骨髓細胞。來源不同，細胞的組成就有差別，所以要考慮到這些差別，不能直接作比較。是哪些因素導致了細胞來源不同，ELISPOT結果就不同呢？

一個因素是陽性細胞在生物體內的分布。我們知道，細胞免疫往往發生在局部的免疫反應部位。比如發生粘膜免疫時，各種免疫細胞就會富集在粘膜器官；發生自身免疫反應時，致敏細胞也往往集中在受累器官。所以，局部器官的淋巴細胞中陽性細胞的比例與血液或者脾臟中陽性細胞占淋巴細胞的比例可能是不相同的。血液與脾臟之間也可能有差別。

另一個因素是APC的含量。不同組織器官來源，甚至不同的分離方法，在淋巴細胞中混合的APC細胞含量也有差異。極端情況（比如待測細胞是經過磁珠純化的）APC含量不足，需要添加APC（人工培養的DC細胞或者“飼養細胞”）。這方面的詳細情況參見第四節。 
所以，標準化必須考慮細胞類型和細胞組成。

細胞狀態
細胞狀態是體現實驗者技術水平與經驗實力的試金石。很多實驗者問我，為什么有些人的ELISPOT結果做得非常好，而另外有些人的結果卻做得非常糟。略去客觀因素不談，主觀因素主要體現在對檢測細胞的處理上。有些人有長期養細胞和做細胞學實驗的基礎，處理細胞來得心應手，獲得的細胞狀態好，活力高，ELISPOT檢測的結果自然就好。反之，有些細胞還沒拿去做ELISPOT檢測之前，已經被折騰得死去大半或者奄奄一息了，這樣能做出好的實驗結果來嗎？！

細胞狀態涉及到細胞來源（包括組織取樣）、細胞分離的方法、以及細胞是否需要凍存復蘇等諸方面。關于保持良好細胞狀態的內容參見第四節；關于細胞分離方法的內容參見第六節；關于細胞凍存復蘇方面的內容參見第七節。

這些環節都要做到標準化，細胞狀態才有保證，實驗結果的重復性與可信度才有保證。

細胞計數
細胞計數看起來很簡單，很多實驗者都忽視它。但是它對ELISPOT結果可信度與重復性的影響是怎么強調也不過分的。因為ELISPOT檢測的是細胞頻率，分子式斑點的數目，分母是細胞的數目。如果經過千辛萬苦，我們把分子（也就是斑點）弄得很漂亮，也弄得很準確，但是分母卻給忽略了，那這個分數值（陽性細胞頻率）能準確嗎？

我們達科為對此有刻骨銘心的感受。我們公司在05-06年曾經有一個ELISPOT研究項目，就是研究相同的凍存細胞與刺激物在不同的實驗室是否能做出相同的結果。我們下了很大的功夫去研究細胞的凍存、復蘇，研究凍存細胞在國內的長途運輸，也下了很大功夫去培訓參與實驗的各個實驗室的人員技術與資質。最后做出來的實驗結果單從斑點與背景上來看無可挑剔，但是有兩個實驗室的數據與其它八個實驗室的數據有較大差異。最后經過詳細的排查，原因竟然出現在血球計數板上！這兩家實驗室的血球計數板質量差，誤差大，導致最后細胞計數誤差竟然達到±40%！

細胞計數最常見的裝備是血球計數板，雖看看起來不是什么高、精、尖設備，但是也代表了一個國家玻璃精加工的水平。我國能夠研制精密的大功率固體激光器，也有水平做出高質量的血球計數板。可惜的是有能力不一定有愿望，目前國產的各種血球其數板經過測試都存在較大的誤差。建議還是購買進口的血球計數板，確實好用。如果一定要用國產的，那請堅持使用同一塊血球計數板。

細胞稀釋也必須認真仔細，取樣之前注意混勻。做重要實驗的時候，最好讓兩個人獨立稀釋和計數，結果相差要控制到10%以內。

刺激物、試劑盒與血清
實驗要取得重復性，刺激物的刺激效果必須要可重復、可再現。一批刺激物用完之后，換下一批刺激物的時候，要做驗證性試驗。另外，有些多肽、蛋白類的刺激物可能在保存的過程中會失活、降解，反復凍融也會造成問題。這就要求預先擬定好刺激物的保存計劃，時隔三個月或者半年就要做一次驗證性的實驗。相關內容參見第四節。

目前市場上的ELISPOT試劑盒都是來自國際知名的公司，不同公司的試劑盒采用的抗體質量都是有保證的。但是大家往往忽略了抗體之外的其他成分，比如封閉液、抗體稀釋液等等。這些也輔助試劑會造成顯著的差別。在追求實驗結果的重復性與可信度的時候，必須引起重視。

血清與內毒素當然是一個重要影響因素，為了實現ELISPOT標準化，提高實驗的可信度與重復性，根本之道是采用無血清ELISPOT技術。相關內容參見第三節和第五節。

實驗操作流程與斑點顯色
本手冊的第三節就是ELISPOT標準化的操作流程，只要遵照執行，應該沒有什么問題。但是有一點需要引起重視，那就是標準化同時也是固定化。往往一個實驗操作步驟有很大的彈性空間，可以這樣做也可以那樣做。如果較真起來，這些做法都有像它的道理，理論與實驗也不能證明誰比誰更優。這才是他們得以同時保留下來的原因。但是一旦實驗室的操作方法固定下來，就不要隨意更改，即便是“等效”的操作也不要隨意變化。標準化其實也是固定化。只要標準操作方案沒有錯誤，就要嚴格執行。

斑點顯色之所以從實驗流程中單列出來，是因為它的重要性。目前ELISPOT有三套顯色系統，一套是PVDF膜上的HRP/AEC顯色系統，顯紅色的斑點；一套是PVDF膜上的AP/BCIP·NBT顯色系統，顯藍色的斑點；一套是透明板上的GABA/銀染系統，顯黑色的斑點。應該說這些顯色系統之間的靈敏度與背景控制都沒有顯著的差別，但是一旦選定一種顯色系統之后，最好長期堅持，以滿足標準化的需要。 
顯色問題除了顯色系統的選擇之外，還要注意顯色溫度與顯色時間。顯色是所有ELISPOT操作中唯一在“室溫”完成的操作步驟。但是，請注意生物學與化中的“室溫”是有嚴格所指的25°C±5°C，而不是籠而統之的所謂“室內溫度”。進入秋冬季以來，我們接到大量客戶電話，說ELISPOT斑點顏色淺，懷疑是不是抗體失活。有意思的是，這些客戶多數集中在長江流域。經過仔細核實，他們的問題幾乎都是由于冬季室內沒有暖氣，室溫過低導致的顯色不足。特別注意：一旦顯色進行了10分鐘以上，再提高溫度就沒什么意義了，因為酶已經大部分失活。

為了實現ELISPOT的標準化，顯色最好在恒溫箱內進行，溫度控制在25°C±5°C，顯色25分鐘為宜。另外，在37°C顯色也是不錯的一個方法，但要注意相應的縮短顯色時間到12-18分鐘，并且顯色中勤檢查。

斑點計數與數據處理
什么樣的點判定為ELISPOT有效斑點，什么樣的點不判定或者盤點為無效點，這就是斑點計數的“尺度”。為了實現標準化，必須統一“尺度”，不能搞“雙重標準”。統一尺度的前提是采用機器自動計數。例如在BioReader4000上，我們一共有十多項獨立的參數，用來描述和判定斑點。這些參數可以單獨保存為“方法文件”。只要“方法文件”中的參數相同，斑點計數的“尺度”也就相同，標準化的斑點計數就有保障。

數據處理，包括數據綜合，陰陽性判斷，數理統計等等。不論怎么處理，應該采取相同的處理方法，這沒有疑問。

綜上所述，ELISPOT標準化的思想就是：在ELISPOT實驗的每一個環節都采用切實有效的步驟和方法，并且固定下來，從而最終保證實驗結果的重復性與可信度。