在細胞分選中，陰選通常是指對非目的細胞進行標記和去除，來得到目的細胞。避免通過直接的標記目的細胞（比如使用表面特異性抗體標記），從而來減少細胞活化可能。因此，陰選方法的優(yōu)勢在于可以保持目的細胞未受刺激的原始狀態(tài)，分選速度快。不過相對陽選而言純度稍低，而且需要事先對原始樣品的細胞組分有所了解，準備相應的標記抗體。

本文將分享一種新的陰選方法和相關數(shù)據(jù)，利用Strep-Tactin^?TACS的瓊脂糖層析柱，這種層析柱既可用于細胞陽選，也能用于細胞陰選中。
 

為了評估Strep-Tactin^?TACS瓊脂糖柱細胞陰選的效率，實驗從外周血單個核細胞（PBMC）樣品中富集了CD3- CD56+自然殺傷細胞（NK）。材料為Strep-Tactin^?TACS瓊脂糖柱以及生物素化的抗體，僅10分鐘，便完成了細胞陰選 （圖1）。
 

流程如下

 

陰選流程：生物素化抗體與PBMC孵育標記非目的細胞，加入至親和層析柱后，即可收集目的細胞

• 將1 x 107 的PBMC細胞用100μl的Buffer稀釋（Buffer CI：含0.5％ BSA的PBS緩沖液，1 mM EDTA）

• 加入多種生物素化抗體，室溫下孵育5分鐘。生物素化的抗體包含以下幾種，每種抗體0.5 μg：CD235a (erythrocytes), CD14 (monocytes), CD3 (T cells), CD15 (granulocytes), CD19 (B cells), CD36 (thrombocytes), CD123 (hematopoietic stem cells) 和CD279 (PD-1)。

• 將孵育好的樣品加入到1 ml的Strep-Tactin^?TACS瓊脂糖層析柱上（柱子最大結合能力：1 x 108個細胞）。

• 當樣品完全進入柱子后，加入10 ml Buffer洗脫兩次，就可以得到未結合的細胞了。后續(xù)使用流式細胞術檢測富集的NK細胞。 

（此處用到的試劑見文末）

結果與討論

NK細胞從6％的起始豐度（圖2A）通過富集達到了86％（圖2B）。所有抗體標記的細胞群幾乎均去除，剩余的非NK細胞主要成分為未標記的細胞。數(shù)據(jù)表明， Strep-Tactin^?TACS瓊脂糖柱不僅可以在陽選中使用，還可以搭配適當?shù)目贵w標記，有效進行細胞陰選。
 

圖2：通過陰選富集PBMC中的CD56 + NK細胞。Strep-Tactin^?TACS瓊脂糖柱與生物素化抗體結合，從而實現(xiàn)NK細胞的富集，純度從6％（A）提高到86％（B）（n = 2）

實驗材料

實驗中使用的Strep-Tactin^?TACS親和層析柱，主要成分Strep-Tactin^?是鏈霉親和素（Streptavidin）的一種突變體，借助鏈霉親和素-生物素作用原理，Strep-Tactin^?與生物素（biotin）的親和力介于100 pM – 100 fM間。當向含有的Strep-Tactin^?層析柱中加入生物素化的抗體時，便能將其固定在柱子中，特異性捕獲細胞，進行陰選。

抗體的選擇

帶Twin-Strep-tag^?的單克隆抗體在生產(chǎn)和純化更便捷，還可以通過加入生物素來洗脫已經(jīng)結合在柱子上的細胞。并且，Twin-Strep-tag^?的單克隆抗體的位置相對更固定一些。

使用生物素化抗體好處在于其與Strep-Tactin^?的親和力相比之下更高，可以稍提高陰選效率，但是總體來說兩種類型的抗體對細胞陰選都是非常有效的。
 

圖：單克隆抗體用生物素（A）或Twin-Strep-tag^?（B）標記，兩種都可以固定在Strep-Tactin^?TACS瓊脂糖層析柱中。

總而言之，作為靈活的細胞研究工具，Strep-Tactin?TACS瓊脂糖層析柱在細胞分選的應用不僅限于陽選，還可以在陰選中結合多種生物素化抗體（或Twin-Strep-tag?標記的抗體）一起使用。整個細胞分選過程只需10分鐘，是一種快速有效的細胞陰選方案。

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