在常規的ELISpot實驗中，每個實驗孔只能檢測一種細胞因子。借助FluoroSpot就可以實現在一個孔內同時檢測兩種或兩種以上的細胞因子或抗體。FluoroSpot擁有ELISpot的靈敏度，并且能夠同時分析幾種分泌物。這種高度靈敏的細胞分析方法相對穩定，易于操作。并且適合于單個檢測和大規模篩選實驗。熒光系統能同時檢測多種分析物，Mabtech以此為依據研發出了高品質的雙色和三色熒光FluoroSpot試劑盒。

• 優勢一：FluoroSpot具有靈敏度高，操作簡便，應用范圍廣等優點。

• 優勢二：FluoroSpot能夠生成更多的數據，節省時間。與免疫斑點相比，使用的細胞和抗原均較少。

FluoroSpot 原理

FluoroSpot能夠分析抗原特異性的多功能T細胞，例如，IFN-γ和IL-2的分析。三明治夾心結構在熒光斑點中得以應用，不同特異性的單克隆捕獲抗體混合物被包被于96孔板的PVDF膜上，生物素標記的檢測抗體識別一種分泌物，tag標記的檢測抗體識別其它的分泌物來實現雙色或三色細胞因子分泌細胞的檢測。檢測通過帶有特定熒光基團的共軛試劑放大信號斑點，可用自動讀板器進行分析。

△雙色FluoroSpot原理圖

△三色FluoroSpot分析 能夠更容易的區分T細胞中不同的細胞因子

三色 FluoroSpot分析總共可以顯示7個亞群：3個單染的細胞因子，3個雙染的細胞因子，1個三色的細胞群。圖像顯示的是一個三色FluoroSpot分析結果。用一組病毒肽（CEF）刺激人的外周血單個核細胞（PBMC），分別用FITC標記IFN-γ、CY3標記IL-2和CY5標記TNF-α。Overylay展示的是三個指標疊后得到的結果。

用途

FluoroSpot用途廣泛，并且同樣適用于單個檢測和大規模篩選。三明治夾心法結合熒光基團標記的檢測試劑能夠對同一個孔中兩個或兩個以上的分析物進行分析。

（一）T-cellFluoroSpot--抗原特異性T細胞檢測的理想方法

通過分泌單，雙和三色細胞因子分析劃分功能性T細胞亞群在許多不同的研究領域均引起極大的興趣。FluoroSpot可用于疫苗開發，主要用于檢測和分析疫苗特異性免疫應答。在癌癥研究中，FluoroSpot可用于，例如監測腫瘤浸潤淋巴細胞或通過同時分析IFN-γ和顆粒酶B的分泌，以提供細胞毒性T細胞反應更直接的評估。Mabtech公司提供了各種不同的熒光斑點試劑盒用于單，雙和三色分析物的T細胞的分析，其中IFN-γ可單獨分析或與幾個不同的分析物同時進行分析。

△HumanIFN-γ/IL-2雙色FluoroSpot

圖為細胞受PPD（純化蛋白衍生物）刺激分泌IFN-γ和/或IL-2的雙色熒光斑點分析。結果顯示在166個分泌IFN-γ的T細胞中，有114個細胞也能分泌IL-2。FITC(IFN-γ)和Cy3(IL-2)的圖像疊加后的斑點代表該細胞同時分泌這兩種細胞因子。

（二）B-cellFluoroSpot--確定分泌抗原特異性抗體細胞的總數

FluoroSpot可實現分析同一個孔中不同免疫球蛋白或亞型的表達情況。其主要應用的領域包括各種疾病和由免疫接種引起的B細胞免疫應答反應。例如，IgG、IgA和IgM的抗原特異性分泌物，可在接種疫苗前后進行檢測。Mabtech公司提供雙色FluoroSpot試劑盒用于檢測人的IgG/IgA和IgG/IgM，以及三色FluoroSpot的試劑盒同時檢測 IgG/IgA/IgM。

（三）其他類型的細胞

FluoroSpot還能夠用于樹突狀細胞、單核細胞和巨噬細胞的研究中，該檢測可以根據細胞因子不同的分布描繪不同的亞群。

注：數據分析FluoroSpot要使用配備有測定不同熒光基團的特定濾光片的自動讀板機。

☆Mabtech公司研發了能夠用于人、小鼠和非人靈長類來源樣本的FluoroSpot試劑盒

具體產品如下：